Human Herpesvirus 6 in Lung Tissue od pacjentów z zapaleniem płuc po przeszczepie szpiku kostnego ad

Wśród 15 osób immunokompetentnych 14 (średni wiek, 33 lata, zakres od 0,25 do 54) to dawcy narządów, którzy zmarli w wyniku urazów spowodowanych wypadkiem samochodowym (4 osoby), zawał mięśnia sercowego (3), zespół nagłej śmierci niemowląt (1 ), rana postrzałowa (1), malformacja serca (1), anafilaksja (1), wodogłowie zastawkowe (1), wisząca (1) lub uraz głowy (1). Jeden dodatkowy pacjent, który miał 44 lata, miał częściową resekcję płuca płucnego raka rakowiaka. Sześć zamrożonych próbek płodowej tkanki płucnej (wiek ciążowy, 58 do 124 dni, średnia, 82) zawierało inny zestaw kontroli. Wszystkie tkanki zostały losowo zakodowane, aby naukowcy wykonujący procedurę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) nie byli świadomi tożsamości żadnego pacjenta. Niezależny obserwator, który nie znał wyników PCR, dokonał retrospektywnego przeglądu wykresów wszystkich 15 biorców przeszczepu szpiku.
Analiza serologiczna HHV-6
Do wykrycia przeciwciał surowicy HHV-6 w układzie do mikromiareczkowania z ekstraktami detergentowymi komórek zakażonych HHV-6 szczepem U1102 lub pozornie zakażonymi komórkami HSB-224 wykorzystano immunoenzymatyczny enzym. Miano punktu końcowego przyjęto jako odwrotność najwyższego dwukrotnego rozcieńczenia o wartości bezwzględnej absorbancji większej niż 0,5 i względnej wartości absorbancji, która była co najmniej dwukrotnie wyższa od antygenu wirusowego niż antygen komórek zakażonych pozornie. Wszystkie próbki surowicy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, a sekwencyjne próbki od pojedynczego osobnika włączono do tej samej analizy w ślepym porównaniu. Zastosowanie tego testu immunoenzymatycznego zostało potwierdzone przez porównanie jego wyników z wynikami uzyskanymi przez immunofluorescencję przeciw rozpętaniu i testy Western blot HHV-625.
Analiza PCR
Przygotowane próbki do PCR przeprowadzono w specjalnym pomieszczeniu przed PCR , w którym operatorzy nosili odzież ochronną i podjęli inne środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek26.
Pięć zamrożonych skrawków (10 mikrometrów) tkanki płuc połączono i trawiono przez noc 100 .g proteinazy K na mililitr. DNA oczyszczono przez ekstrakcję fenolem, fenolem-chloroformem i chloroformem, a następnie wytrącono octanem sodu (300 mM), glikogenem (100 ug na mililitr) i ml etanolu. Uzyskany oczyszczony DNA ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,2 ml 10 mM TRIS (pH 8). Każdą z próbek poddano trzykrotnej amplifikacji: raz przy użyciu pary starterów HHV-6 101R (nieznana funkcja genetyczna), jednokrotnie z parą primerów HHV-6 5R (ekson homologiczny do genu HC87 UL87) i raz ze starterami beta-globinowymi. Oba zestawy starterów HHV-6 wytwarzały określone produkty podczas testów z DNA z 20 izolatów HHV-6, a oba nie reagowały z oczyszczonym DNA z 10 izolatów wirusa opryszczki pospolitej, 10 izolatów cytomegalowirusa, szczepu wirusa Epsteina-Barr, izolat wirusa ospy wietrznej-półpaśca i 2 izolaty ludzkiego herpeswirusa 7. Mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM chlorku potasu; 1,5 mM chlorku magnezu; 10 mM TRIS kwas solny (pH 8,4); U rekombinowanej polimerazy DNA Taq (AmpliTaq, Perkin-Elmer Cetus); 200 mikrometrów trifosforanu deoksyguanozyny, trifosforanu deoksyadenozyny, trifosforanu deoksytymidyny i trifosforanu deoksycytydyny (Pharmacia); 0,83 mikromola (2,5 x 1013 cząsteczek) każdego startera oczyszczonego za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (Midland Certified Reagents, Midland, Tex.); i 10 mikrolitrów próbki w końcowej objętości 50 mikrolitrów
[podobne: nfz kielce przeglądarka skierowań, wodorotlenek wapnia stomatologia, apteka legnica dyżur ]

Dodaj komentarz