Human Herpesvirus 6 in Lung Tissue od pacjentów z zapaleniem płuc po przeszczepie szpiku kostnego cd

Amplifikacje HHV-6 i beta-globiny przeprowadzono w rozcieńczeniach próbek w zakresie od 0 (nierozcieńczony) do 10-5. Procedura termocyklingu polegała na denaturacji w temperaturze 94 ° C przez 6 minut, 30 cyklach wyżarzania w temperaturze 55 ° C przez minutę, wydłużeniu w 72 ° C przez minutę i denaturacji w temperaturze 94 ° C przez minutę, a następnie ostatecznemu wydłużeniu. w 72 ° C przez 10 minut. Równoległe amplifikacje zawierające próbkę DNA i 100 kopii egzogennego DNA HHV-6 udokumentowały brak endogennych inhibitorów amplifikacji. Kontrola negatywna składała się z odczynników PCR bez próbki DNA (od jednego do trzech na przebieg), a porcja niezakażonych komórek HSB-2 była dopasowana i przetworzona z każdą próbką. Żadna z kontroli ujemnych nie była pozytywna w PCR podczas badania. Płynną hybrydyzację stosowano do wykrywania produktów amplifikacji przez hybrydyzację 7 mikrolitrów produktów PCR z 106 cpm znakowanej 32P sondy i poddawanie hybryd do elektroforezy w nieendenującym akrylamidowym żelu27. Autoradiogramy wysuszonych żeli rutynowo wytwarzały określone prążki, gdy do PCR dodano 10 genomów HHV-6. Ryc. 1. Ryc. 1. Reprezentatywne produkty PCR z 8 z 30 próbek tkanek płucnych od biorców przeszczepów szpiku kostnego. Pierwsza kolumna przedstawia produkty PCR ze starterami HHV-6 dla ośmiu pacjentów z próbkami DNA w rozcieńczeniach 0 (nierozcieńczonych), 10-1 i 10-2. Kolumna 3 pokazuje produkty PCR dla startera beta-globiny z próbkami DNA w rozcieńczeniach 10-3, 10-4 i 10-5. Kolumny 2 i 4 pokazują liczbę kopii HHV-6 i beta-globiny obliczoną dla 10 mikrolitrów nierozcieńczonego DNA próbki. Kolumna 5 pokazuje stosunki kopii HHV-6 (liczba x 106) do kopii beta-globiny, obliczenia, które dostosowuje oszacowania DNA HHV-6 dla zmian w wielkości próby i odzysku. Stosunki te uzyskano przez porównanie próbek w różnych rozcieńczeniach z skalibrowanymi miareczkowaniami zawierającymi od 0 do 104 genomów HHV-6 lub ludzkiego DNA (pola po prawej stronie wykresu). Gdy analiza PCR próbek przy różnych rozcieńczeniach nie zbliżyła się do punktu końcowego (np. Próbka / A w kolumnie 1), dodatkowe rozcieńczenia zostały wzmocnione (dane nie pokazane). Pokazane tu wartości HHV-6: beta-globiny różnią się od odpowiednich wartości w Tabeli 1, ponieważ stosunki uśredniono, gdy osobnik miał więcej niż jedną próbkę tkanki, a wartości DNA w Tabeli (wyrażone jako liczba HHV-6 genomy na 106 genomów komórkowych) podwojono w celu skorygowania diploidalnej reprezentacji genu beta-globiny.
Standardowe krzywe rozcieńczeń DNA HHV-6 i DNA komórkowego były zawarte w każdym przebiegu (Figura 1). Intensywności pasm zamplifikowanych rozcieńczonych próbek porównano z natężeniem standardowych krzywych rozcieńczenia po amplifikacji w celu oszacowania liczby HHV-6 i ludzkich genomów w każdej próbce28. Wartości uzyskane w wyniku wielokrotnych pomiarów tych samych próbek w różnych seriach były w granicach 0,6 log10 względem siebie. Aby zrekompensować zmiany w wielkości próby i stopniu odzyskiwania DNA po oczyszczeniu, oszacowano genomy HHV-6 jako liczbę genomów HHV-6 na milion komórkowych genomów (genomy HHV-6 na 106 komórek). W przypadkach, w których z jednego pacjenta oceniano więcej niż jeden blok tkankowy, ostateczną ocenę ilościową obliczono przez obliczenie średniej geometrycznej wartości.
Analiza statystyczna
Korelacje rang Spearmana wykorzystano do oceny korelacji stężeń DNA i przeciwciał
[przypisy: znamię dysplastyczne, laryngolog w dublinie, apteka kluczbork dyżur ]

Dodaj komentarz